Ⅰ. 概述：Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 利用了Dojindo開(kāi)發(fā)的水 溶性四唑鹽 — WST?-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3- (4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽)，它 在電子載體1-Methoxy PMS存在的情況下能夠被還原 成水溶性的甲臜染料。 CCK-8溶液可以直接加入到細(xì)胞樣品中；不需要預(yù)配 各種成分。CCK-8法是用于測(cè)定細(xì)胞增殖或毒性實(shí)驗(yàn) 中活細(xì)胞數(shù)目的一種高靈敏度，無(wú)放射性的比色檢測(cè) 法。WST?-8被細(xì)胞內(nèi)脫氫酶氧化還原后生成的橙黃 色甲臜染料能夠溶解在組織培養(yǎng)基中，生成的甲臜量 與活細(xì)胞數(shù)量成正比。

Cell Counting Kit-8（CCK-8試劑盒）是由同仁化學(xué)研究所（Dojindo）開(kāi)發(fā)的檢測(cè)細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性的試劑盒，為MTT法的替代方法，試劑盒中采用自己開(kāi)發(fā)的水溶性四唑鹽-WST-8，在美國(guó)，歐洲等國(guó)家地區(qū)均持有專利，同仁化學(xué)研究所于2006年在中國(guó)獲得了WST-8的注冊(cè)商標(biāo)。 
CCK-8法與普通的MTT法相比，具有顯著特點(diǎn)：
★靈敏度高，數(shù)據(jù)可靠，重現(xiàn)性好
★操作簡(jiǎn)便，省時(shí)省力
★水溶性，不需要換液，尤其適合于懸浮細(xì)胞
★無(wú)需放射性同位素和有機(jī)/溶劑，對(duì)細(xì)胞毒性低
★為1瓶溶液，毋需預(yù)制，即開(kāi)即用
★適合于高通量藥物篩選
CCK-8用途：藥物篩選、細(xì)胞增殖測(cè)定、細(xì)胞毒性測(cè)定、腫瘤藥敏試驗(yàn)
CCK-8試劑盒在國(guó)內(nèi)知名科研院所、重點(diǎn)大學(xué)、三甲醫(yī)院被廣泛應(yīng)用，國(guó)際認(rèn)可度高，使用CCK-8發(fā)表的中外文獻(xiàn)達(dá)600多篇，其中截止08年底SCI影響因子IF＞10分的論文有37篇，最高IF26.5分
[Heterozygosity with respect to Zfp148 causes complete loss of fetal germ cells during mouse embryogenesis,Nature Genetics 33, 172 - 176 (01 Feb 2003)]
 CCK-8試劑與MTT等方法靈敏度比較

 

CCK-8試劑毒性：CCK-8和其他檢測(cè)方法對(duì)比可以得出——CCK-8對(duì)細(xì)胞幾乎無(wú)毒性，不傷害細(xì)胞，細(xì)胞可重復(fù)利用

Ⅲ. 注意事項(xiàng)

1. 首次實(shí)驗(yàn)時(shí)，建議參考文獻(xiàn)上的實(shí)驗(yàn)條件或做預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索接種細(xì)胞的數(shù)量和加入CCK-8試劑后的顯色時(shí)間。方法：取已知細(xì)胞數(shù)量的細(xì)胞懸液加入到培養(yǎng)板中，然后用培養(yǎng)基依次等比例稀釋成一個(gè)系列濃度的細(xì)胞懸液，細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間后加CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)，過(guò)0.5-1 h，從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)板觀察顏色是否發(fā)生明顯變化？如果沒(méi)有，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，過(guò)1 h左右從培養(yǎng)箱中拿出觀察顏色變化?6?8?6?8直到顏色發(fā)生明顯梯度變化后，用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定，并記錄下反應(yīng)時(shí)間。

2. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的天數(shù)，若是細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，一般選取O.D.值在0.2-1.0 (扣除空白后) 范圍內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量；若是做藥物對(duì)細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)，一般選取O.D.值在1.0-2.0 (扣除空白后) 范圍內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量。但也存在有部分細(xì)胞的O.D.值達(dá)不到1.0的情況。

3. 接種時(shí)請(qǐng)充分混勻細(xì)胞懸液，保證每孔接種細(xì)胞數(shù)量接近一致。如果細(xì)胞容易聚團(tuán)，建議每接種幾個(gè)孔后，將細(xì)胞懸液重新混勻后再接種。

4. 培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)板邊緣孔內(nèi)的培養(yǎng)基易揮發(fā)，為了減少誤差，建議培養(yǎng)板邊緣孔只加培養(yǎng)基，而不作為指標(biāo)檢測(cè)孔。

5. 為了減少差異，請(qǐng)盡量采用多通道移液器。加入CCK-8時(shí)，建議45°斜貼培養(yǎng)板孔壁加樣，切勿直接插入培養(yǎng)基液面下，否則容易產(chǎn)生氣泡，影響檢測(cè)結(jié)果。

6. CCK-8試劑加入時(shí)需快速，盡可能減少試劑在移液器上的殘留所帶來(lái)的誤差，也可用培養(yǎng)基稀釋CCK-8試劑1倍，混勻后每孔加入20 ?8?6l，減小復(fù)孔間誤差。

7. 加完CCK-8后，請(qǐng)輕微傾斜培養(yǎng)板使培養(yǎng)基覆蓋培養(yǎng)板孔壁上殘留的CCK-8，并輕輕拍打培養(yǎng)板使CCK-8和培養(yǎng)基混勻。如果培養(yǎng)基需要換液，可將CCK-8與培養(yǎng)基按照1:10的比例混勻后添加。

8. 試劑中所含的WST?-8會(huì)與還原劑反應(yīng)，生成WST?-8甲臜從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。若實(shí)驗(yàn)中所采用的藥物具有還原性，請(qǐng)?jiān)诩尤隒CK-8前進(jìn)行換液。

9. 若細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，培養(yǎng)基顏色、pH值等條件易發(fā)生改變，此時(shí)加入CCK-8前需換液。

10. 如果樣品為高渾濁度的細(xì)胞懸液，建議采用雙波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)450-490 nm，600-650 nm作為參比波長(zhǎng)。

11. 由于CCK-8幾乎無(wú)細(xì)胞毒性，細(xì)胞可在實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行中性紅法或結(jié)晶紫法等其他實(shí)驗(yàn)。

12. 如果要測(cè)定細(xì)胞的具體數(shù)量，建議先做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

 

Ⅳ. 參考文獻(xiàn)

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