RNA Trip LS (液體樣品總RNA提取試劑) R1020
貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 價格 |
R1020 | RNA Trip LS (液體樣品總RNA提取試劑) | 100ml | 650元 |
描述:RNA Trip LS (液體樣品總RNA提取試劑)特別加強(qiáng)了對液體標(biāo)本如全血、懸浮細(xì)胞、病毒樣品等RNA的提取能力。用RNAtrip LS試劑提取液體標(biāo)本RNA時,無需事先分離其中的細(xì)胞、細(xì)菌、病毒等病原微生物,直接將液體標(biāo)本與RNAtrip LS試劑混合即可,極大簡化了樣品的提取前處理過程。并且其提取能力強(qiáng)大,甚至可以從已經(jīng)凝固的血液塊中提取出高純度的RNA。使用方法與RNAtrip 和TRIzol相似,可在30-60分鐘內(nèi)完成。獲得的高純度總RNA可用于RT-PCR、Northern Blot、RNA酶保護(hù)、Poly(A) mRNA純化、體外翻譯等實驗。
血液RNA提取試劑(#R1040)具有與RNAtrip LS相似的特征,可以使用同一說明書。
儲存:4 oC密封避光保存一年以上有效。
適用:
(1) 液體標(biāo)本(200 μl/ml): 全血、體液、尿液,懸浮細(xì)胞、病毒微生物樣品等。
(2) 培養(yǎng)細(xì)胞 (5-10 x 106細(xì)胞/ml): 真核細(xì)胞,細(xì)菌,酵母。
(3) 固體組織 (50-100 mg/ml ): 人、動物、植物的各種新鮮或凍存組織。
操作準(zhǔn)備:
極微量的RNA酶都會導(dǎo)致RNA降解。RNA酶污染主要來自以下五個方面:(1) 來自實驗人員的雙手。(2) 來自器皿、吸頭離心管、自備液體。(3) 組織細(xì)胞破碎不可避免地釋放內(nèi)源RNA酶。(4) RNA未能完全與蛋白質(zhì)分離。(5) RNA沉淀和溶解時來自吸頭離心管和溶液。我們的Step by Step質(zhì)量監(jiān)測表明,RNAtrip LS試劑可100%抑制內(nèi)源性和實驗用品引入的外源RNA酶污染,并在隨后的分離步驟極為有效地清除蛋白包括RNA酶。因此在有RNAtrip LS存在的情況下高壓消毒30分鐘的吸頭離心管和溶液,可以勝任RNA提取操作。然而,一旦離開RNAtrip LS試劑的保護(hù),如在沉淀和溶解步驟,來自吸頭離心管和液體的RNA酶污染可能導(dǎo)致RNA降解。因此在這些步驟應(yīng)嚴(yán)格使用高壓消毒用品。戴手套無疑是有益的,但戴口罩和帽子則無必要。只要嚴(yán)格按照本指南進(jìn)行準(zhǔn)備和操作,使用RNAtrip LS試劑總是能獲得完整的高純度總RNA。這里描述的僅是針對RNAtrip LS試劑的實驗準(zhǔn)備方案,對其它來源RNA提取試劑未做全面檢查。
1. 固體組織破碎設(shè)備。準(zhǔn)備下列裝置之一,1)玻璃勻漿器。必要時泡酸清潔,用高壓滅菌蒸餾水洗滌數(shù)次。2)研缽。適用于液氮凍存組織的研磨,清洗方法同玻璃勻漿器。3)組織細(xì)胞超聲破碎儀器。探頭插入裝滿蒸餾水的試管或燒杯中,開啟超聲清洗探頭30秒至1分鐘。4)高速機(jī)械勻漿器(Polytron,Tekmar或類似產(chǎn)品)。打開開關(guān),在蒸餾水中清洗分散器頭數(shù)次。對這些裝置的部分部件高壓消毒30分鐘是保險的措施,但使用RNAtrip LS這種處理并不必要。
2. 高壓蒸汽30分鐘消毒一次性吸頭離心管。RNA沉淀和溶解之后,應(yīng)嚴(yán)格使用高壓消毒的一次性用品。然而RNAtrip LS能在RNA酶污染環(huán)境下工作,在裂解步驟可使用未高壓但潔凈的一次性吸頭和離心管,但僅推薦在緊急情況下這樣做。由于不可預(yù)測的原因,如動物已經(jīng)處死,組織已取出,細(xì)胞已收取,而吸頭和離心管尚未高壓處理。這僅適用于RNAtrip LS試劑,對其它來源RNA提取試劑無效。此時保險做法是使用普利萊公司的組織RNA保護(hù)液(Cat# R1030),把來不及處理的標(biāo)本保存在RNA保護(hù)液中,25 oC保存2周,4 oC保存4周,-20 oC保存數(shù)月,標(biāo)本中RNA不會降解。
3. DEPC處理的雙蒸水。加DEPC到水中至終濃度為0.01% v/v,室溫過夜,高壓消毒30分鐘。用于溶解RNA,配制TE緩沖液和75%乙醇。
4. 普通雙蒸水。高壓消毒30分鐘,用于沖洗器皿,配制瓊脂糖凝膠和電泳用緩沖液。注意溶液配制后高壓滅菌,但瓊脂糖不能高壓處理。
5. 冰盒和濕冰。在冰上進(jìn)行操作有助于減少RNA降解。
6. 異丙醇,氯仿,純乙醇,分析純。75%乙醇用高壓消毒的蒸餾水配制。
7. 其它用品:電泳槽,雙蒸水沖洗。離心機(jī)和加樣器,無需處理。
8. 戴手套。注意某些實驗如提取質(zhì)粒DNA使用大量RNA酶,為防污染須特別清洗實驗器具和實驗區(qū)域。
RNA提取程序
1. 組織細(xì)胞破碎與裂解
冰上操作。立即并快速破碎組織至關(guān)重要。組織細(xì)胞過量不僅使RNA得率下降,還將導(dǎo)致DNA和蛋白質(zhì)污染。在緊急情況下,如動物已處死,組織已取出,細(xì)胞已收取,異地取送標(biāo)本,用戶尚未做好實驗準(zhǔn)備時,推薦用戶把組織細(xì)胞儲存在RNA保護(hù)液(Cat# R1020)中,保證標(biāo)本中的RNA不會降解。
(1) 液體標(biāo)本:全血、體液、尿液,懸浮細(xì)胞、病毒微生物樣品等。每200ml液體樣品加1 ml RNAtrip LS,置冰上。未抗凝的凝固血液按固體組織處理。
(2) 培養(yǎng)細(xì)胞。貼壁細(xì)胞:棄培養(yǎng)基,用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞一次。每5-10′106個細(xì)胞加1 ml RNAtrip LS試劑,但加入量必須有效地覆蓋瓶皿的細(xì)胞表面。一個75 cm2瓶皿的細(xì)胞通常需要 2 ml提取液,一個35 cm2瓶皿的細(xì)胞需要 1 ml提取液,更小的培養(yǎng)瓶皿可使用更少的提取液,但后續(xù)操作會因體積過小而極為不便?;蝿悠棵蠡蛴梦^吹打使提取液流過并裂解所有細(xì)胞。置冰上1-5分鐘,傾斜瓶皿使粘稠的裂解物聚于一處以便取出。懸浮細(xì)胞:低速離心收集細(xì)胞,將細(xì)胞快速重懸于50-100ml的PBS或去離子水中,每5-10′106細(xì)胞加1 ml RNAtrip LS裂解。注意直接裂解未重懸的細(xì)胞沉淀,裂解物將十分粘稠而難以分散。細(xì)菌酵母:離心收集沉淀,加入50-100ml去離子水重懸細(xì)胞。每107細(xì)胞加入1-2 ml RNAtrip LS直接裂解。某些細(xì)菌和酵母細(xì)胞可能需要勻漿破碎。
(3) 動物組織。按比例每50-100 mg組織加1 ml RNAtrip LS試劑。用研缽研磨:僅適用于液氮凍存組織。組織放在研缽中研成粉末,加1 ml RNAtrip LS試劑,繼續(xù)研磨至組織完全裂解。用玻璃勻漿器勻漿:加入RNAtrip LS上下手動勻漿組織10-15次。用高速機(jī)械勻漿器:將組織放入塑料試管內(nèi),試管置冰浴燒杯中,加入RNAtrip LS試劑,將分散器頭垂直插入管內(nèi)與組織塊接觸,轉(zhuǎn)速12,000-20,000 rpm,上下移動試管10-20次,直到組織完全打散,無肉眼可見大塊。有些結(jié)締組織難以完全打碎,可以繼續(xù)下一步操作。用超聲儀:需根據(jù)機(jī)器型號進(jìn)行預(yù)試驗,選取能有效破碎組織的功率和時間。
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