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多種探針標(biāo)記檢測(cè)系統(tǒng)

基于地高3辛、生物素和熒光標(biāo)記分子的標(biāo)記和檢測(cè)系統(tǒng)是常見(jiàn)的原位雜交檢測(cè)方法。

熒光標(biāo)記檢測(cè)常為直接探針標(biāo)記方法，如在dUTP/UTP/ddUTP上連接Fluorescein后進(jìn)行核酸標(biāo)記。由于標(biāo)記在核酸上的熒光分子必須經(jīng)受雜交和洗脫過(guò)程中的考驗(yàn)，以及熒光分子易于衰減，其檢測(cè)靈敏度受到一定的影響。但對(duì)熒光分子的直接檢測(cè)呈現(xiàn)的背景較低。

原位雜交中探針的選擇

DNA探針、RNA探針和寡核苷酸探針均能通過(guò)不同的酶促分子反應(yīng)進(jìn)行標(biāo)記。寡核苷酸探針的長(zhǎng)度較短，因此避免了探針內(nèi)部退火的問(wèn)題，在雜交時(shí)的滲透能力也更好，探針與靶標(biāo)的接觸這是影響原位雜交是否成功的重要因素之一。DNA探針、RNA探針在合成時(shí)需要控制探針片段長(zhǎng)度，通常300-1000bp左右，能覆蓋到較長(zhǎng)片段的靶核酸序列，增加檢測(cè)的靈敏度。

雜交液中的陽(yáng)離子濃度通過(guò)靜電排斥作用影響了雜交體之間的鏈穩(wěn)定性，較高的鹽濃度將增加雜交體的穩(wěn)定性。大于0.4M的Na離子濃度，對(duì)Tm值、雙鏈復(fù)性速率的影響不大，但隨著Na離子濃度的降低，將顯著影響Tm值和雙鏈復(fù)性速率。

有2機(jī)溶2劑（甲酰胺）的作用是降低DNA-DNA和DNA-RNA等雙鏈體的解鏈溫度。通常DNA需要在0.1~0.2M Na+ 90~100℃的條件下變性，那么應(yīng)用于原位雜交，樣品必須在65~75℃的條件下進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間變性，這將導(dǎo)致樣品形態(tài)學(xué)的破壞。50%甲酰胺的應(yīng)用能將雜交溫度降至30~45℃。

硫酸葡聚糖具有很強(qiáng)的水合性，高濃度的硫酸葡聚糖會(huì)使得核酸分子無(wú)法獲得周邊親水環(huán)境，增加了探針濃度，加快雜交反應(yīng)速率。