細胞核蛋白和胞漿蛋白制備試劑盒

貨號：ZK-PL3514

品牌：子科生物ZIKER

描述：用于從哺乳動物組織和培養(yǎng)細胞中提取核蛋白和/或胞漿蛋白，提取制備過程簡便。制備的核蛋白和胞漿蛋白能保持天然活性，并且純度高。提取的蛋白適于轉(zhuǎn)錄因子活性分析、凝膠阻滯實驗(gel shift assay, EMSA)、免疫共沉淀、酶活性測定，也適于Western Blot實驗。

組份：

溫馨提示：

1. 操作應(yīng)在冰浴中進行，試劑需提前預(yù)冷。

2. 根據(jù)大致的細胞數(shù)，或大致估計離心后的細胞體積(Packed cell volume,PCV)來確定試劑的加入量。PCV因細胞類型不同而有所差異。細胞數(shù)、PCV

與試劑加入量之間的對應(yīng)關(guān)系，參見下表：

操作步驟:

1.裂解：(1) 培養(yǎng)細胞，PBS洗滌細胞兩次，根據(jù)細胞計數(shù)，或者估計離心后的細胞體積PCV。每1 ×106個細胞加入50~100ul的CEB-A，刮下細胞轉(zhuǎn)移

至預(yù)冷的1.5ml離心管；或者每體積PCV細胞加入5倍PCV體積的CEB-A (即10~20 ul PCV的細胞加50~100ul的CEB-A)，劇烈振蕩重懸。

裂解: 

(2) 組織樣本，精確稱重后剪成小塊，PBS洗滌。通常每10mg動物組織相當(dāng)于1×106個細胞，需加入50~100ul CEB-A，參照上表按比例加入。

在冰上使用玻璃勻漿器勻漿組織，通常需要20~40次上下抽動勻漿，棄去筋膜組織。切記勿用高速電動勻漿器或超聲破碎組織避免破壞細胞器結(jié)構(gòu)。

2.裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的1.5ml離心管，劇烈振蕩30秒，冰浴10~15min，期間每5分鐘振蕩15秒。

3.可選步驟：根據(jù)步驟2裂解物體積，加入1/20體積的CEB-B，振蕩10秒，冰浴1min (加入CEB-B可去除部分核膜蛋白，適于制備高純度的核蛋白用

于EMSA凝膠阻滯實驗等，但可使胞漿蛋白出現(xiàn)很少量的膜蛋白污染。若制備高純度胞漿蛋白可跳過此步驟。若制備核蛋白僅用于普通的Western

Blot目的，則無須高純度核蛋白，也可省略此步驟。

4. 胞漿蛋白組分的制備：將步驟2或步驟3的上清，12000g 4oC 離心5min，勿觸動沉淀，將上清轉(zhuǎn)移到新管，此即胞漿蛋白組分，可立即使用或

?20~?70oC保存。

5. 胞核粗提組分的制備：取第步驟4的原離心管，12000g 4oC瞬時離心，盡量吸除上清，保留沉淀。加入100ulCEB-A和5ulCEB-B，振蕩10秒，

重懸沉淀，冰浴1min，

1000g 5min，棄上清。再次加入100ulCEB-A和5ulCEB-B重懸沉淀冰浴1min,1000g 5min，盡棄上清，保留沉淀。

6. 胞核蛋白的制備：加50~100ul預(yù)冷NEB重懸步驟5的離心沉淀，劇烈振蕩15秒，冰上30min，期間每10min振蕩15秒。12000g 5min，上清液含核蛋白成分，其中含有25%的甘油；可立即使用或?20~?70oC保存。

說明：

1. 嚴(yán)格按照說明書操作，每106個細胞大約得到50-75ug蛋白。

2. 裂解時間是重要的，過短則細胞裂解不全導(dǎo)致蛋白產(chǎn)率低，裂解時間長則導(dǎo)致胞漿

蛋白有核蛋白污染。

3.只需對提取的胞漿蛋白定量(Braford或BCA法)，核蛋白純度高但含量低，無需定量，對于同一個制備，核蛋白與胞漿蛋白的量

于相平行。

4. 上述制備的蛋白樣品與2xSDS-PAGE混合即可上樣電泳。

5. 切記采用手動玻璃勻漿器，勿用高速電動勻漿器或超聲破碎組織細胞，避免破壞細胞器結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致分離的組分污染。玻璃勻漿器須配套選用間隙嚴(yán)緊的研杵，其特征是將研杵插入勻漿器套管后，提起研杵而套管不會脫落。

正確勻漿是先下壓旋轉(zhuǎn)研杵擠破組織，然后上下緩慢推拉研杵破碎細胞。組織樣品制備效果不如細胞樣品。