熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。

一般而言，熒光擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實驗方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

定量PCR方法:

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。

實時熒光定量PCR：

實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

實驗過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

三、注意事項

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行。zui好設(shè)立一個專用的PCR實驗室。

２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

人胰島素受體底物2(IRS-2)ELISA試劑盒Phospho-Zap-70 (Tyr319)/Syk (Tyr352) Antibody20 ul

人胰島素自身抗體(IAA)ELISA試劑盒Phospho-Zap-70 (Tyr319)/Syk (Tyr352) Antibody100 ul

人細胞凋亡抑制因子(IAP)ELISA試劑盒Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) (D57.2.2E) XP? Rabbit mAb (Alexa Fluor? 700 Conjugate)100 ul

人抑制素A(INH-A)ELISA試劑盒DYRK1B Antibody100 ul

人抑制素(INH)ELISA試劑盒Phospho-Zap-70 (Tyr493)/Syk (Tyr526) Antibody20 ul

人抑制素β-B(Inhbb)ELISA試劑盒Phospho-Zap-70 (Tyr493)/Syk (Tyr526) Antibody100 ul

人抑制素B(INH-B)ELISA試劑盒Zap-70 (99F2) Rabbit mAb100 ul

人流感病毒抗體IgG(FLU)ELISA試劑盒Zap-70 (136F12) Rabbit mAb (Alexa Fluor? 647 Conjugate)100 ul
鮭腎桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒2-甲基estradiol-d378.125-5000pg/mlGrem1|GREM1(GremLin 1)|DAND2|DRM|Cell proliferation-inducing gene 2 protein|CKTSF1B1|gremLin 1|cysteine knot superfamily|homolog|DAN domain family member 2|GREMLIN|Down-regulated in Mos-transformed cells protein|DRMM|gremLin|gremLin-1|gremLin 1-like protein|IHG-2|Increased in high glucose protein 2|increased in high glucose-2|proliferation-inducing gene 2

semiamitraz-d3鹽酸鹽1.56-100ng/mlFabp7|FABP7|B-FABP|BLBP|B-FABPDKFZp547J2313|BLBPMRG|Brain lipid-binding protein|Brain-type fatty acid-binding protein|FABPBbrain lipid binding protein|Fatty acid-binding protein 7|fatty acid-binding protein|brain|Mammary-derived growth inhibitor related|mammary-derived growth inhibitor-related

a-887826-d80.312-20ng/mlTert|TERT(Telomerase Reverse Transcriptase)|CMM9|DKCA2|DKCB4|EST2|PFBMFT1|TCS1|TP2|TRT|Telomerase-associated protein 2|Telomerase catalytic subunit

n-2-aminomethyl-n-hydroxyacetyl-7-chloro-2,3-dihydro-5 -（2-氟苯基）- 1h-1,4-benzodiazepine）β- d-glucuronide醋酸甲0.312-20ng/mlSirt3|SIR2L3|SIR2-like protein 3|SIRT3|EC 3.5.1|EC 3.5.1.-|hSIRT3|mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide-dependent deacetylase|NAD-dependent deacetylase sirtuin-3|mitochondrial|SIR2L3silent mating type information regulation 2|S.cerevisiae|homolog 3|sir2-like 3|SIR2-like protein 3|sirtuin(silent mating type information regulation 2 homolog) 3(S. cerevisiae)|sirtuin(silent mating type information regulation 2|S.cerevisiae|homolog) 3|sirtuin 3|sirtuin type 3

N [ 1（R）- ethyloxycarbonyl-3-phenylpropyl ] - L-丙氨酸叔丁酯0.156-10ng/mlCspg4|MCSP|AN2|CSPG4|HMW-MAA|MCSPG|MEL-CSPG|chondroitin sulfate proteoglycan 4|chondroitin sulfate proteoglycan 4(melanoma-associated)|EC 3.6.3|HMW-MAA|MCSPChondroitin sulfate proteoglycan NG2|MCSPGMelanoma chondroitin sulfate proteoglycan|MEL-CSPG|MSK16Melanoma-associated chondroitin sulfate proteoglycan|NG2EC 2.7.8

type MMTV integration site family|member 3A

強的松龍0.25-16ng/mlSema3g|SEMA3G|sem2|Semaphorin sem2

加巴噴丁二腈15.6-1000pg/mlUcn|UCN(Urocortin)|UI|UROC|urocortin|preproprotein|UROCUI

2-carboxyanthracene MTSEA酰胺0.313-20ng/mlRnaset2|RNASET2|RNASE6PL|Ribonuclease T2|Ribonuclease 6

犬尿氨酸丙氨酸78-5000pg/mlAimp1|AIMP1|SCYE1|EMAP-II|aminoacyl tRNA synthetase complex-interacting multifunctional protein 1|EMAP-2|EMAPII member 1(endothelialmonocyte-activating)|endothelial-monocyte activating polypeptide II|Multisynthase complex auxiliary component p43|multisynthetase complex auxiliary component p43

3-o-benzyl雌甾四烯15.6-1000pg/mlAkr1b1|AR|AKR1B1(Aldose reductase)|Aldo-keto reductase family 1 member B1

Orientin血管內(nèi)皮細胞粘附分子1檢測試劑盒20mg

羌活(寬葉羌活)  英文名稱：Rhizoma et Radix Notopterygii (w Ye Qianghuo)   保存：-20℃   規(guī)格：0.5g 突觸細胞粘附分子3抗體  

Mangiferin富馬比索洛爾標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：規(guī)格：人解整合素樣金屬蛋白酶9(ADAM9)CLIA試劑盒 0.2ml

人熱休克蛋白60(Hsp60)ELISA試盒SAMD3  SAMD3蛋白抗體規(guī)格:96T/48TBupivacaine Related Compound A規(guī)格:500mg白介素受體相關(guān)激酶檢測試盒20mg小鼠結(jié)腸癌細胞，CT26.WT細胞1x10^6cells

Crotaline血管內(nèi)皮抑素抗體檢測試劑盒20mg

蟾它靈 訂購|咨詢 規(guī)格： 10mg 化表皮生長因子受體抗體 NPSR ELISA Kit 神經(jīng)肽S受體(NPSR)ELISA試劑盒

Neomangiferin波生坦標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：規(guī)格：人抗存活素抗體(Anti-Survivin antibody)CLIA試劑盒 0.2ml

cFn(Human cellular fibronectin) ELISA kit  人細胞纖維連接蛋白CAS號：鹽阿霉素核孤兒受體4A1檢測試盒250mgHuman/人Elisa試盒3172529

99%1g5g輔酶ADeoxyribonuclease I Like Protein 3

O-(2,3,4,5,6-五氟芐基)羥鹽鹽(>98.0%(HPLC)(N)) 質(zhì)量規(guī)格：>98.0%(HPLC)(N) O-(2,3,4,5,6-Pentafluorobenzyl)hydroxylamine Hydrochloride

進口、分裝備解素P子補體檢測試盒1gHuman/人Elisa試盒50709358

98%5g1g輔酶Q10Karyopherin Alpha 2

 MDA-MB-175VII(人腺導(dǎo)管細胞)5×106cells/瓶×2

進口、原裝3,4二羥基抗體檢測試盒5gHuman/人Elisa試盒50709369

98%1g25g輔酶Q10keratansulphate

五氟芐(>98.0%(GC)) 質(zhì)量規(guī)格：>98.0%(GC) Pentafluorobenzyl Bromide

Brucella Agar彎曲桿菌的抗生素敏感性試驗和純化培養(yǎng)凝血子XIIa檢測試盒20mg抗傷寒Vi多糖IgM抗體檢測試盒Asprosin